Tema 27 Anticuerpos. Inmunoglobulinas. Estructura general. El parátopo. Clases de inmunoglobulinas. La reacción antígeno-anticuerpo. Aplicaciones. Técnicas inmunológicas básicas. Anticuerpos monoclonales.

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-         Cuando se produce la invasión por un agente patógeno, el mecanismo inmunológico que se activa va en dos direcciones: a) Producción de anticuerpos específicos (Respuesta Humoral) y b) si hay células implicadas, tanto tras una infección, por transformación celular, etc., se desencadena una respuesta mediada por células citotóxicas (Respuesta Celular).

 

Moléculas de reconocimiento del sistema inmune. Anticuerpos:

-         Durante la respuesta inmune, 3 tipos de moléculas diferentes son capaces de reconocer y unir antígeno: Las inmunoglobulinas (anticuerpos), El TCR (receptor de los linfocitos T) y las moléculas del MHC (Complejo Principal, o mayor, de Histocompatibilidad). En este capítulo hablaremos sólo de las primeras.

-         Los anticuerpos (Ac) o inmunoglobulinas (Ig) son un grupo de glicoproteínas presentes en el suero sanguíneo y líquidos corporales que se unen específicamente al antígeno en las fases de reconocimiento y efectora de la inmunidad humoral. Existen más de 107-109 moléculas de Ac diferentes en cada individuo.

-         Pertenecen al grupo de las gammablobulinas del suero y se dividen en 5 tipos diferentes: IgG (la más abundante en plasma sanguíneo), IgA (abundante en secreciones y mucosas. Forma dímeros), IgM (Implicada en la respuesta primaria y formada por un pentámero), IgD (de función todavía por esclarecer) y la IgE (muy poco abundante e implicada en procesos de alergia).

-         Los linfocitos B son las únicas células capaces de sintetizar Ac, que pueden anclarse en la superficie celular y actuar como receptores para el antígeno o secretarse al medio.

 

-Estructura general:

-         La estructura básica de cualquier Ig consiste en 4 cadenas polipeptídicas unidas entre sí por puentes disulfuro.

-         Existen 2 cadenas ligeras (L) idénticas (24 kD aprox. cada una) y dos cadenas pesadas (H de heavy) de doble tamaño y también idénticas entre sí (55 o 70 kD cada una).

-         Tanto las cadenas pesadas como ligeras tienen series de unos 110 Aa de longitud que se pliegan independientemente en un motivo globular común denominado dominio de las Ig. Estos dominios suelen mantenerse “cerrados” mediante puentes S-S.

-         Otras muchas moléculas de importancia en inmunología tienen esa estructura, formando lo que se denomina la superfamilia de las Ig.

-         Las cadenas pesadas y ligeras de las Ig se componen de regiones variables (V) amino terminales y regiones constantes (C) carboxi terminales.

-         La región V de una cadena H (VH) se asocia con la región V de una cadena L  (VL) para formar un sitio de unión al antígeno (por lo que en una molécula de Ig puede haber 2 sitios de unión a Ag...).

-         Los dominios de la región C de las cadenas pesadas interaccionan con otras moléculas y células efectoras del sistema inmune, por lo que el reconocimiento antigénico y las funciones efectoras de las moléculas de Ac están separadas espacialmente en la región V y la región C, respectivamente:

-         Región Constante (CL y CH) que no varía mucho entre anticuerpos de la misma clase y subclase (constituyen el isotipo y el alotipo, como ya veremos).

-         Región variable (VL y VH) que es diferente entre los diferentes anticuerpos (constituyen el idiotipo).

-         Las 4 cadenas de las Ig se unen en forma de Y con una región central bisagra. Con proteasas vegetales (pepsina, papaína) se liberan dos fragmentos proteicos:

-         El tallo se denomina Fragmento cristalizable (Fc) y es la región constante por donde el Ac puede unirse a la célula con un receptor específico.

-         La parte bifurcada de la Y constituye el fragmento denominado Fragmento de unión al antígeno (Fab: fragment antigen-binding). Es la zona más variable y se une a cada determinante antigénico compatible.

-         Como ya hemos dicho, la estructura se mantiene tanto por puentes S-S entre cadenas (4) como intracatenarios, formando los bucles denominados dominio de inmunoglobulina.

-         En los dominios variables de las Ig existen 3 regiones que son especialmente variables de unas Ig a otras y se denominan regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o regiones de hipervariabilidad. Con el plegamiento espacial, las regiones CDR se proyectan hacia el exterior y forman la superficie de interacción con el Ag.

-         Pequeñas variaciones en la secuencia de Aa de las regiones constantes definen distintos tipos de Ig. Hay 5 clases o isotipos de cadenas pesadas: m, d, g, a, e, (que darán lugar a las Ig IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente) y dos de cadenas ligeras: l y k.

-         Además, pequeñas variaciones dentro de los isotipos IgG e IgA permiten diferenciar 4 subclases de IgG y 2 de IgA.

-         Por lo tanto hay 9 isotipos de Igs, cada uno de los cuales puede contener cadenas ligeras l ó k.

-         El isotipo (variaciones de las regiones constantes de las cadenas pesadas) se mantiene constante en todas las moléculas de todos los individuos de la misma especie.

-         A diferentes formas alélicas (pequeños cambios en las zonas constantes de las cadenas pesadas y ligeras) que distinguen las Ig de unos individuos a otros de la misma especie se le denomina Alotipo.

-         Las moléculas de Ig individuales y específicas que difieren en la región hipervariable de la porción Fab se le denomina Idiotipo.

-         Aunque la especificidad la proporciona la región variable, muchas funciones dependen del isotipo:

-         IgM: Respuesta 1ª a patógenos (supone el 10% del total de Igs). Suele ser un pentámero (5 moléculas unidas por puentes S-S y por una cadena J de unión (joining)). No atraviesa la placenta por su gran tamaño. Activa la vía clásica del complemento contra bacterias. (existe una IgM hexamérica más eficaz uniendo complemento…). También actúa como receptor para el Ag en las células B no estimuladas.

-         IgG: Es la principal Ig del suero humano (80% del conjunto). Es monomérica. Está presente también en líquidos tisulares. Actúa contra bacterias y virus favoreciendo la fagocitosis y neutralizando toxinas. También activa la vía clásica del complemento y puede atravesar la placenta, dando inmunidad pasiva natural intraútero. También participa en la inmunidad neonatal, además de en la CCDA (citotoxicidad celular dependiente de Ac).

-         IgA: Supone el 15% de las Igs. La mayor parte está en forma dimérica unida por una cadena J. Es la Ig presente en las superficies mucosas y secretoras asociadas a MALT (vías respiratorias, tracto digestivo, genitourinario, saliva, lágrimas y leche materna…). En el intestino puede unirse a los virus, bacterias y parásitos protozoarios impidiendo que se adhieran a la superficie de las mucosas (exclusión inmunitaria). Activa la vía alternativa del complemento. También proporciona inmunidad neonatal.

-         IgD: Monomérica y se encuentra en pequeñas cantidades en el suero. No fijan complemento y no atraviesan la placenta. Abundan sobre la superficie de los linfocitos B y ligan antígeno, iniciando la diferenciación de estas células hacia la producción de anticuerpos. Sólo se conoce su función como receptor para el Ag en células B no estimuladas.

-         IgE: Está en muy poca proporción. Monomérica y está implicada en algunos tipos de alergias.

 

Reacción Ag-Ac. Aplicaciones. Técnicas básicas:

-         Cuando un Ag con varios sitios de unión a un Ac se mezcla con dicho Ac específico en un tubo de ensayo, ambos se unirán formando inmunocomplejos. En las concentraciones correctas (zona de equivalencia), Ag y Ac forman una amplia red de moléculas unidas de forma no covalente, de tal manera que la mayoría o todas las moléculas de Ag y Ac quedan unidas en grandes masas.

-         Si aumentamos la concentración de Ag (exceso de Ag) o el Ac (exceso de Ac), los inmunocomplejos pueden disociarse en agregados más pequeños, muchas veces solubles.

 

-    Muchas de las reacciones basadas en interacciones entre Ag y Ac ya han sido descritas en temas anteriores: ELISA, RIA, Western, IF, IP, Hemaglutinación…

-         Como también se ha comentado, todos estos métodos pueden utilizarse tanto en clínica como en investigación.

-         A continuación vamos a completar esta sección con más métodos de diagnóstico y/o investigación que tienen como base reacciones inmunológicas:

-         Inmunoprecipitación, ELISA, Westernblot o citofluorimetría de flujo (hacer pasar unas células unidas a Ac por un detector específico para su cuantificación o separación) son métodos tanto para investigación como para clínica. Ya descritos.

-         Técnicas de inmunodifusión: Con el principio básico de interacción y precipitación en una base semisólida (agar…) de complejos Ag-Ac, se han desarrollado varias pruebas de diagnóstico muy utilizadas en clínica:

-         Inmunodifusión doble: Ag y Ac difunden en agar y al encontrarse interaccionan llegando a producir un precipitado visible. Permite identificar, ver contaminantes y sacar información del tamaño de los componentes...

-         Inmunodifusión simple radial: Solo difunde un componente (A). El segundo (B) está mezclado uniformemente con el agar. Al difundir (A), producirá un halo de precipitación, que será mayor cuanto mayor sea la concentración de (A).

-         Inmunoelectroforesis: En un primer paso, el Ag se separa en una matriz semisólida por electroforesis. A continuación se realiza algo similar a lo visto en la inmunodifusión doble. Esto permite identificar proteínas concretas del suero de pacientes…

 

 Anticuerpos monoclonales

-         Cuando se elaboran Ac contra un Ag concreto, lo normal es la producción de un pool de Ac dirigidos contra diferentes epítopos. Diferentes clones de linfocitos B producirán Ac con idiotipos específicos para cada uno de los epítopos presentes en el Ag. A este conjunto de especificidades se les denomina: Ac policlonal.

-         Estos Ac son muy utilizados en técnicas de inmunoprecipitación, terapia contra algunos tumores o, en general, cualquier técnica que no requiera la identificación de un péptido o epítopo concreto del inmunógeno…

-         Sin embargo, en ocasiones se pueden utilizar Ac que tienen un idiotipo uniforme y específico capaz de reconocer un solo epítopo: Ac monoclonales.

-         Desarrollados por Georges Kohler y Cesar Milstein en el 1975 (recibieron el Nobel por ello), el método en sí es simple:

-         Se le inocula a un ratón el antígeno contra el que queremos obtener mAc.

-         Se purifican los esplenocitos (células del bazo) y se fusionan con células de mieloma (células que no producen Ac pero que proporcionan "la inmortalidad"…

-         A partir de aquí, se seleccionan, por dilución límite, aquellos clones que producen el Ac que queremos…