Replication and transcription of bacteriophage ø29 DNA



Group leader: Margarita Salas Falgueras,
Scientific Staff: Ana Inmaculada Camacho Pedrero, Miguel De Vega José,
Postdoctoral Fellows: Mario Mencia Caballero,
Graduate Students: David Ballesteros Plaza, Isabel Maria Holguera Lopez,
Technical Assistance: José Mª Lázaro Bolos, Angeles M. Villarraso, Laurentino Villar García,



Research Summary

We have continued with the study of the structural and functional bases of the mechanism of ø29 DNA replication initiated by TP-priming. ø29 DNA polymerase residue Tyr148 has a functional role in primer-terminus stabilization at the 3’-5’ exonuclease active site and Val250 has a role as metal-dNTP complex ligand and in protein-primed initiation. We have shown the involvement of the TPR2 subdomain movement in the activities of the DNA polymerase in TP-DNA replication and in circular DNA replication. By using optical tweezers we have analyzed the dynamics of the communication between the polymerization and exonuclease activity of the ø29 DNA polymerase. We have constructed chimerical ø29 DNA polymerases with improved DNA amplification performance by fusion of DNA binding motifs. We have shown that the ø29 TP directs early organization of ø29 DNA replication at the bacterial nucleoid recruiting the phage DNA polymerase. Later on, both proteins, as well as ø29 protein p16.7, form helical structures at the periphery of the infected cells dependent on the three MreB actin-like cytoskeleton proteins. These proteins are required for the efficient replication of ø29 DNA. We have characterized an AP endonuclease activity in the B. subtilis DNA polymerase X that enables the latter to recognize, incise and further repair abasic sites.
In the study of the control of transcription of ø29 DNA we have shown the formation of a nucleoprotein-hairpin and its role in transcription regulation. On the other hand, the heterogeneous expression of B. subtilis protein Spo0A during logarithmic growth mediated by Kinc/D proteins is responsible of the partial suppression of ø29 development. In addition, Spo0A suppresses differentially the development of phages ø29 and Nf due to a smaller effect on the transcription and replication of Nf DNA.




Figure 1. Modeling of the chimerical DNA polymerase. The figure represents the structural model of a (HhH)2 domain (colored in cyan) joint through a linker peptide (in dark blue) to the C-terminus of ø29 DNA polymerase (colored in violet).




Figure 2.ø29 terminal protein (TP) localizes at the bacterial nucleoid. YFP, DAPI staining and merged images of typical Bacillus subtilis cells expressing a xylose-induced YFP-TP fusion protein analyzed 30 min after addition of the inductor.
 

Publications

Alcorlo, M., Jiménez, M., Ortega, A., Hermoso, J.M., Salas, M., Minton, A.P. and Rivas,G. (2009) Analytical ultracentrifugation studies of phage ø29 DNA protein p6 binding to DNA. J.Mol.Biol. 385, 1616-1629.
 
Rodríguez, I., Lázaro, J.M., Salas, M. and de Vega, M. (2009). Involvement of the TPR2 subdomain movement in the activities of ø29 DNA polymerase. Nucl. Acids Res. 37, 193-203.
 
Castilla-Llorente, V., Salas, M. and Meijer, W.J.J. (2009). Different responses to Spo0A-mediated suppression of the related Bacillus subtilis phages Nf and ø29. Environm. Microbiol. 11, 1137-1149.
 
Castilla-Llorente, V., Meijer W.J.J. and Salas, M. (2009). Differential Spo0A-mediated effects on transcription and replication of the related Bacillus subtilis phages Nf and ø29 explain their different behaviours in vivo. Nucl.Acids Res. 37, 4955-4964.
 
de Vega, M. and Salas, M. (2009) Bacteriophage ø29 DNA polymerase: An outstanding replicase. In: Kundsen, W.D. and Bruns, S.S. (eds.) Bacterial DNA, DNA polymerase and DNA helicases. Nova Science Publishers Inc., pp. 329-351.
 
Muñoz-Espín, D., Daniel, R,. Kawai, Y., Carballido-López, R., Castilla-Llorente, V., Errington, J., Meijer, W.J.J. and Salas, M. (2009). The actin-like MreB cytoskeleton organizes viral DNA replication in bacteria. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 106, 13347-13352.
 
Pérez-Arnaiz, P., Lázaro, J.M., Salas, M. and de Vega, M. (2009). Functional importance of bacteriophage ø29 DNA polymerase residue Tyr148 in primer-terminus stabilisation at the 3’-5’ exonuclease active site. J. Mol. Biol. 391, 797-807.
 
Ibarra, B., Chemla, Y.R., Plyasunov, S., Smith, S.B., Lázaro, J.M., Salas, M. and Bustamante, C. (2009). Proofreading dynamics of a processive DNA polymerase. EMBO J., 28, 2794-2802.
 
Salas, M. (2009). A passion for research. Cell Mol. Life Sci. 66, 3827-3830.
 
Gutiérrez del Arroyo, P., Vélez, M., Piétrement, O., Salas, M., Carrascosa, JL. and Camacho,A. (2009). A nucleoprotein-hairpin in transcription regulation. J. Struct. Biol. 168, 444-451.
 
Salas, M. and Camacho, A. (2010). DNA bending and looping in the transcripcional control of bacteriophage ø29. FEMS Mircbiol.Rev. 34, 828-841.
 
Muñóz-Espín, D., Holguera, I., Ballesteros-Plaza, D., Carballido-López, R. and Salas, M. (2010). Viral terminal protein directs early organization of phage DNA replication at the bacterial nucleoid. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 107, 16548-16553.
 
Pérez-Arnáiz, P., Lázaro, J.M., Salas, M. and de Vega, M. (2010). Ø29 DNA polymerase active site: role of residue Val250 as metal-dNTP complex ligand and in protein-primed initiation. J.Mol.Biol. 395, 223-233.
 
de Vega, M., Lázaro, J.M., Mencía, M., Blanco, L. and Salas, M. (2010). Improvement of ø29 DNA polymerase amplification performance by fusion of DNA binding motifs. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 107, 16506-16511.
 
Baños, B., Villar, L., Salas, M. and de Vega, M. (2010). Intrinsic AP endonuclease activity enables Bacillus subtilis DNA polymerase X to recognize, incise and further repair abasic sites. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 107, 19219-19224.
 
Camacho, A. and Salas, M. (2010). Molecular interactions and protein-induced DNA hairpin in the transcriptional control of bacteriophage ø29 DNA. Int.J.Mol.Sci. 11, 5129-5142.

 

 

Meijer, W. J.J., Muñoz-Espín, D., Castilla-Llorente V. and Salas, M. (2007) Phage phi29: membrane-associated DNA replication and mechanism of alternative infection strategy. In Bacteriophage: Genetics and Molecular Biology. Ed. Stephen McGrath. Horizon Scientific Press. pp 273-305.

Salas, M. (2007) 40 years with bacteriophage ø29. Annu. Rev. Microbiol.61, 1-22.

Muñoz-Espín, D., Fuertes, M.A., Jiménez, M., Villar, L., Alonso, C., Rivas, G., Salas M. and Meijer, W.J.J. (2007) Structural and functional analysis of ø29 p16.7C dimerization mutants: identification of a novel aromatic-cage dimerization motif. J. Biol.Chem. 282, 16521-16531.


Mendieta, J., Pérez-Lago, L., Salas, M. and Camacho, A. (2007) DNA sequence-specific recognition by a transcriptional regulator through indirect readout of A-tracts. Nucl.Acids Res. 35, 3252-3261.


Alcorlo, M., González-Huíci, V., Hermoso, J.M., Meijer, W.J.J. and Salas, M. (2007) The phage ø29 membrane protein p16.7, involved in DNA replication, is required for efficient ejection of the viral genome. J. Bacteriol. 189, 5542-5549.

Berman, A.J., Kamtekar, S., Goodman, J.L., Lázaro, J.M., de Vega, M., Blanco, L., Salas, M. and Steitz, T.A. (2007) Structures of phi29 DNA polymerase complexed with substrate: the mechanism of translocation in B-family polymerases. EMBO J. 26, 3494-3505.

de Vega, M. and Salas, M. (2007) A highly conserved Tyrosine residue of family B DNA polymerases contributes to dictate translesion synthesis past 8-oxo-7, 8-dihydro-2’-deoxyguanosine. Nucl. Acids Res. 35, 5096-5107.


Serrano-Heras, G., Ruiz-Masó, J., del Solar, G., Espinosa, M., Bravo, A. and Salas, M. (2007). Protein p56 from the Bacillus subtilis phage ø29 inhibits DNA-binding ability of uracil-DNA-glycosylase. Nucl. Acids Res. 35, 5393-5401.


Alcorlo, M., Salas, M. and Hermoso, J.M. (2007) In vivo DNA binding of bacteriophage GA-1 protein p6. J. Bacteriol. 189, 8024-8033.


 Pérez-Arnaiz, P., Longás, E., Lázaro, J.M., Salas, M. and de Vega, M. (2007) Involvement of phage ø29 DNA polymerase and terminal protein subdomains in conferring specificity during initiation of protein-primed DNA replication. Nucl.Acid Res. 35, 7061-7063.


Salas, M., Blanco, L., Lázaro, J.M. and de Vega, M. (2008) My favorite enzyme: the bacteriophage ø29 DNA polymerase. IUBMB Life. 60, 82-85.


Salas M. and de Vega, M. (2008) Replication of bacterial viruses. In Encyclopedia of Virology Third Edition, 5 vols. (B.W.J. Mahy and M.H.V. Van Regenmortel, Editors). Oxford: Elsevier Vol. 4, pp. 399-406 .


Lahoud, G., Timoshchuk, V., Lebedev, A., de Vega, M., Salas, M., Aarar, K., Hou, Y-M. and Gamper, H.. Enzymatic synthesis of structure-free DNA with pseudo-complementary properties. Nucl. Acids Res. 36, 3409-3419.

Castilla-Llorente, V., Salas, M. and Meijer, W.J.J. (2008) kinC/D-mediated heterogeneous expression of spo0A during logarithmical growth in Bacillus subtilis is responsible for partial suppression of ø29 development. Mol. Microbiol. 68, 1406-1417.


Baños, B., Lázaro, J.M., Villar, L., Salas, M. and de Vega, M. (2008). Editing of misaligned 3'-termini by an intrinsic 3'-5' exonuclease activity residing in the PHP domain of a family X DNA polymerase. Nucl. Acids Res. 36, 5736-5749.


Serrano-Heras, G., Bravo, A. and Salas, M. (2008). Phage ø29 protein p56 prevents viral DNA replication impairment caused by uracil excision activity of uracil-DNA glycosylase. Proc.Natl.Acad. Sci.USA. 105, 19044-19049.


Longás, E., Villar, L., Lázaro, J.M., de Vega, M. and Salas, M. (2008). Phage ø29 and Nf terminal protein-priming  domain specifies the internal template nucleotide to initiate DNA replication. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 105, 18290-18295.


Baños, B., Lázaro, J.M., Villar, L., Salas, M. and de Vega, M. (2008). Characterization of a Bacillus subtilis 64-kDa DNA Polymerase X Potentially Involved in DNA Repair. J. Mol. Biol. 384, 1019-1028.

 

Awards

Profesora Honoraria de la Universidad Autónoma de Madrid (2008-2009 y 2009-2010).
Académica de Honor de la Academia Malagueña de Ciencias (2009– ).
Nombrada Embajadora Honoraria de la Marca España (EHME) en la categoría de Ciencia e Innovación por el Foro de las Marcas Renombradas (2009– ).
Premio a “Toda una vida profesional” de la Fundación Mapfre (2009).
Calle “Margarita Salas” de Arroyo de la Encomienda de Valladolid (2009).
Miembro del Comité Asesor Internacional Campus de Excelencia de la Universidad de Oviedo (2009–).
Miembro del Comité Asesor Internacional del Instituto de Medicina Predictiva y Personalizada del Cáncer (IMPPC) (2009– ).
Doctora Honoris Causa por la Universidad de Málaga (2009).
Medalla de Oro del Colegio Oficial de Veterinarios del Principado de Asturias (2009).
Miembro del Comité Científico Externo del Instituto de Investigación Sanitaria de la Fundación Jiménez Díaz (IIS-FJD) (2009–).
Socia de Honor de Compromiso Asturias XXI (2009-).
Miembro de la Junta Consultiva de la Universidad de Oviedo (2007-2010).
Nombrada Académica de Honor de la Academia Canaria de Ciencias, Santa Cruz de Tenerife (2009–).
Premio Personaje 50Plus de la Fundación Bayard (2010).
Premio Especial del Jurado “Salud y Bienestar” de la Fundación Pilates (2010).
Presidenta del Real Patronato de la Biblioteca Nacional de España (2010).

Margarita Salas.
?    Académica de Honor de la Real Academia de Ciencias Veterinarias (2007–).
?    Presidenta del Jurado de los Premios “Íñigo Álvarez de Toledo”. Madrid (2007)
?    Distinción Aulas con nombre de mujer “Margarita Salas” de la Concejalía de la Mujer del Excmo. Ayuntamiento de Alhaurin de la Torre de Málaga (2007).
?    Beca de Honor “Fernando Abril Martorell” Fundación de la Universidad Carlos III de Madrid (2007).
?    Miembro de la Junta Consultiva de la Universidad de Oviedo (2007–)
?    Miembro de la National Academy of Sciences of USA (2007–).
?    Instituto de Enseñanza Secundaria de Villanueva de la Torre “NEWTON-SALAS” (2007).
?    Premio Especial a la Investigación Científica a la Trayectoria Vital y Profesional concedido por la Sociedad Española del Dolor (2007).
?    Distinción Centro de Educación Infantil y Primaria “Margarita Salas” Arroyo de la Encomienda. de Valladolid (2007).
?    Miembro del Comité Científico Externo del Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud (2008–).
?    Legado en la Caja de las Letras en el Instituto Cervantes (2008).
?    Distinción Laboratorio de Biología y Geología “Margarita Salas” IES Las Lomas, Alicante (2008).
?    XII Premio “Purificación Tomás” concedido por la Agrupación Municipal Socialista de Oviedo a los logros conseguidos en el ámbito científico. Oviedo (2008).
?    Miembro Comité Científico del III Congreso Interuniversitario de Biotecnología. León (2008).
?    Nombrada por SSMM El Rey Juan Carlos, Marquesa de Canero por su valiosa entrega a la investigación científica sobre Biología Molecular (2008).
?    Miembro del Patronato de la Fundación Duques de Soria (2008–).
?    Miembro del Consejo Científico Asesor del Cento de Investigación Príncipe Felipe (2008–).
?    Presidenta del Jurado de los Premios “Íñigo Álvarez de Toledo”. Madrid (2008).
?    XL Lección Conmemorativa Jiménez Díaz (2008).
?    Distinción “Centro de Educación de Personas Adultas Margarita Salas” Cabezón de la Sal. Cantabria (2008).
?    Miembro del Comité Científico del Proyecto Consolider en Nanociencia Molecular del Institut de Ciéncia Molecular de la Universidad de Valencia (2008– )
?    Premio de la Asociación de Directivos de Comunicación y la Asociación de la Prensa de Madrid (DIRCOM) en reconocimiento a su trayectoria profesional en investigación y ciencia. (2008).
?    Residenta de Honor Residencia Alfonso VIII de Valladolid. (2008).

Doctoral Theses

LAURA PEREZ GARCÍA (2007) Especificidad en la interacción de la proteína p4 con el DNA y formación del complejo regulador de la transcripción del bacteriófago ø29. Director Tesis: Ana Camacho. Universidad Autónoma de Madrid.

MARTIN ALCORLO PAGÉS  (2007) Estudio de la interacción de la proteína p6 con el DNA del bacteriófago ø29 de Bacillus subtilis. Director Tesis: José M. Hermoso. Universidad Autónoma de Madrid.

VIRGINIA CASTILLA LLORENTE (2008) Estudio de los mecanismos moleculares responsables de la adaptación del desarrollo de los bacteriófagos ø29 y Nf al estado fisiológico de la célula de Bacillus subtilis infectada. Director Tésis: Wilfried J.J. Meijer. Universidad Autónoma de Madrid.

PATRICIA PEREZ ARNAIZ (2008). Relación estructura-función en la DNA polimerasa del bacteriófago ø29. Papel del dominio intermedio de la proteína terminal en el reconocimiento específico de la DNA polimerasa. Director Tesis: Miguel de Vega. Universidad Autónoma de Madrid.

ELISA LONGÁS TORNÉ. (2008). Caracterización funcional de las DNA polimerasas de los bacteriófagos Nf y GA-1. Estudio del mecanismo de iniciación de la replicación con proteína terminal. Directores Tesis: Margarita Salas y Miguel de Vega. Universidad Autónoma de Madrid

Other activities

PATENTES/PATENTS

Método para la replicación, amplificación o secuenciación de un ADN molde. Inventores: Margarita Salas Falgueras, Miguel de Vega José, José Mª Lázaro Bolós, Luis Blanco Dávila, Mario Mencía Caballero. Fecha: 2 de Julio, 2009
Número de Patente: P200930412 Licenciada a X-Pol Biotech, S.L.
 
Quimera de ADN polimerasa del fago ø29. Inventores: Margarita Salas Falgueras, Miguel de Vega José, José Mª Lázaro Bolós, Luis Blanco Dávila, Mario Mencía Caballero. Fecha: 2 de Julio, 2009
Número de Patente: P200930413. Licenciada a X-Pol Biotech, S.L.
 


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