MANIPULACIÓN GENÉTICA DE ORGANISMOS SUPERIORES: TRANSGENIZACIÓN

 

FIGURAS (Presentación PowerPoint):

Desarrollo del tema

Algunas fotos y esquema en plantas

Resumen de transferencia génica

 

1.      CONTEXTUALIZACION

2.      INTRODUCCIÓN

3.      APLICACIONES DE LA TRANSGENIZACIÓN

4.      PRODUCCIÓN DE ORGANISMOS TRANSGÉNICOS

5.      TRANSFERENCIA GÉNICA EN CÉLULAS EMBRIONARIAS PLURIPOTENCIALES

6.      TRANSFERENCIA GÉNICA MEDIADA POR RETROVIRUS

7.      NOMENCLATURA PARA RATONES TRANSGÉNICOS

8.      TRANSFERENCIA GÉNICA EN PLANTAS

9.      BIBLIOGRAFÍA

 

 

1. CONTEXTUALIZACION

Para justificar la necesidad de dedicar al menos el presente capítulo a la elaboración y caracterización de organismos transgénicos, genéticamente modificados, basta con acudir a cualquier medio de comunicación actual: la polémica sobre el etiquetado de alimentos transgénicos, la necesidad o no, según organismos ecologistas, de dichas modificaciones genéticas, el jugar a ser dioses creando especies con herencia genética propia y susceptibles de ser patentados. Seguro que el fantasma de Frankenstein vaga por la mente de más de uno, aunque, al contrario que en el monstruo creado por Mary Shelley, en la transgenización se crearía vida nueva a partir de organismos vivos preexistentes.

Al contrario de lo que podría parecer en un principio, la técnica de transgenización hace disminuir en los laboratorios el número necesario de animales de experimentación, pues el hecho de poder introducir genes funcionales en dichos animales permite acotar mucho más ciertos procesos y sistemas biológicos.

La metodología de la transgenización ejerce una gran influencia sobre muchas disciplinas y áreas de investigación tales como biología, bioquímica, biología molecular, inmunología, microbiología, virología o medicina, constituyendo un instrumento insustituible para el estudio de la expresión, regulación y función génica.

Para desarrollar en todas sus posibilidades la transgenización, se requieren amplios conocimientos de biología molecular, bioquímica, anatomía y fisiología animal, así como algunos conocimientos básicos de técnicas quirúrgicas.

 

2. INTRODUCCIÓN

¿Qué es un animal transgénico?. Una definición precisa, pero simple, podría ser la siguiente: Un animal transgénico es un animal que porta en su genoma genes nuevos. Dichos genes suelen ser introducidos mediante microinyección de DNA purificado en el pronúcleo de huevos fertilizados. Si el nuevo material genético se integra en el DNA cromosomal del organismo, éste se transmitirá a las sucesivas progenies como una carga hereditaria más propia del animal manipulado.

Históricamente, a partir de los años 70 se produjo un avance muy rápido en las técnicas de ingeniería genética, las cuales se aplicaban desde a células bacterianas aisladas hasta organismos eucarióticos uni ó multicelular (incluyendo a sistemas animales superiores). De hecho, el conocimiento último del desarrollo y regulación de la expresión génica específica de tejido se consigue sólo en estudios en animales in vivo.

Desde un punto de vista histórico y aunque las modernas técnicas del DNA recombinante son importantísimas, los tempranos estudios de embriología en mamíferos resultaron cruciales para el desarrollo de las tecnologías de transferencia génica. Estos primeros estudios se remontan a más de un milenio, aunque no fuera hasta 1891 cuando el grupo de Heape describe los primeros éxitos de transferencia de embriones. En 1966, Lin describe la exitosa microinyección de gotas de aceite y g-globulina bovina dentro de zigotos murinos. En 1977, Gurdon transfiere mRNA y DNA en huevos de Xenopus y observan un procesamiento correcto del ácido nucleico y producción de proteínas. En 1981, Gordon y Ruddle acuñan la palabra transgénico como una variante animal originada tras la introducción de un gen, o genes, nuevo en su genoma y, finalmente, Brinster y Palmiter (Harvey Lect. 80, 1-38) describen, en 1986, la introducción de genes dentro de la línea germinal de animales.

Actualmente, la utilización de animales transgénicos representa una de las herramientas de investigación más potentes y completas de las ciencias biológicas. Sin embargo y debido a la naturaleza de dicha herramienta per sé, ha sido necesario la elaboración de la denominada Legislación sobre Organismos Modificados Genéticamente. Dicha legislación proporciona normativas para la protección de animales de experimentación y el uso de organismos modificados genéticamente. Como ejemplo se puede mencionar el Real Decreto 951/1997 que establece el régimen jurídico de la utilización confinada, liberación voluntaria y comercialización de organismos modificados genéticamente, con el fin de prevenir el riesgo para la salud humana y el medio ambiente (B.O.E. 150, 24 de junio de 1997).

 

3. APLICACIONES DE LA TRANSGENIZACIÓN

La producción de organismos transgénicos constituye una herramienta fundamental en investigación y representa la convergencia de avances previos en el área de las tecnologías del DNA recombinante y manipulación de cultivos celulares y embriones. La transgenización representa un modelo primordial para explorar la regulación de la expresión génica así como la regulación de procesos celulares y fisiológicos. El uso de esta técnica en biomedicina, agricultura, biología y biotecnología requiere la capacidad de dirigir y controlar los niveles de expresión génica.

Desde la embriología hasta la virología, pasando obviamente por bioquímica y biología molecular, las aplicaciones de ratones transgénicos proporcionan modelos en muchas disciplinas y áreas de investigación, destacando las siguientes aplicaciones:

·         Bases genéticas de enfermedades humanas y animales, así como el diseño de estrategias de terapia.

·         Modelos para investigación de terapia génica.

·         Modelos como banco de pruebas de diferentes drogas y medicamentos varios.

·         En biotecnología, modelos de "granjas moleculares", donde se pueden obtener grandes beneficios económicos con diseños transgénicos en industrias agropecuarias.

·         En estudios de biología molecular, modelos de animales transgénicos permitirían analizar los efectos de la modulación, activación o, por el contrario, supresión de la expresión génica.

 

Se han descrito muchos trabajos biomédicos donde se han utilizado estrategias de manipulación genética de animales. Algunos de los cuales y detallados en el trabajo: Strategies in transgenic animal science (Monastersky and Robl), son:

·         Patogénesis viral

·         Enfermedades cardiovasculares

·         Neuropatologías relacionadas con el b-Amiloide y enfermedad de Alzheimer

·         Diabetes y obesidad

·         Metabolismo del colesterol

·         Autoinmunidad

·         Desarrollo de protocolos para terapia génica

·         Patogénesis producidas por poliovirus

·         Toxicología

·         Estudios de inmortalización celular

 

Entre los aspectos más importantes que se deberían tener en cuenta a la hora de emprender el desarrollo de técnicas de transgenización cabría destacar:

·         Impacto medioambiental de la posible liberación del animal transgénico

·         Aceptación pública

·         Consideraciones éticas

·         Legislación

·         Seguridad en el caso de producir comida manipulada genéticamente

·         Aspectos de patente, economía y uniformidad del producto.

En cualquier caso, existen algunas incógnitas de consideración a la hora de tratar animales y alimentos transgénicos: ¿Podrían aparecer nuevas enfermedades o producirse un salto interespecífico de alguna enfermedad concreta?; ¿Podrían crearse organismos altamente patógenos artificialmente? ¿Cuál sería el verdadero impacto medioambiental de algunos productos transgénicos si se liberan en la naturaleza?.

 

4. PRODUCCIÓN DE ORGANISMOS TRANSGÉNICOS

Aunque con una base molecular y concepto similar, obviamente la elaboración de un animal transgénico difiere en gran medida del de una planta. Nosotros nos vamos a centrar, básicamente, en los procesos necesarios para la creación de un animal transgénico, comentando al final de forma sucinta las diferencias básicas con la transgenización en plantas.

Concretamente nos vamos a centrar en la producción de un ratón transgénico, empezando por la elección del modelo murino que más se ajuste a nuestros intereses de investigación. La selección de la raza o cepa animal adecuada es tan crucial que puede definir, sencillamente, el éxito o fracaso del proceso. En líneas generales, el proceso de transgenización cuenta con los siguientes pasos:

1.      Determinar, caracterizar y purificar el material genético que va a ser transferido.

2.      Superovular la hembra del animal elegido antes de cruzarlo con el macho.

3.      Extraer los embriones y proceder a la manipulación genética antes de la fusión de los pronúcleos.

4.      Transferir los embriones transgenizados, viables, a una hembra pseudopreñada.

5.      Tras el nacimiento de la progenie, analizar y caracterizar aquellos que han asimilado la modificación genética. Establecer una línea transgénica.

 

4.1 Preparación y purificación del DNA

Originariamente, la técnica de transferencia génica por excelencia consistía en la microinyección, donde el fragmento de DNA a transferir (el transgén) era introducido directamente en el pronúcleo masculino (mayor que el femenino) del embrión mediante microagujas y microscopio de micromanipulación. El tamaño del fragmento a microinyectar no era muy relevante, y la inserción en el genoma celular solía ser al azar. Originariamente, el tamaño era impuesto por los vectores de clonación utilizados: 12 kb para un plásmido y hacia 45 kb para un cósmido. Otros métodos de clonaje, como los bacteriófagos y cromosomas artificiales bacterianos pueden llegar a manejar hasta varios cientos de kb de DNA exógeno. Sin embargo, fragmentos muchísimo más grandes (alrededor de 1-2 Mb) empezaron a ser transferidos, a lo largo de la última década, mediante el empleo de los cromosomas artificiales de levadura (Yeast Artificial Chromosomes, YAC) y fragmentos directos cromosomales, donde la integración en el genoma celular no es necesaria puesto que el transgén dispone de todos los elementos necesarios para su perpetuación. Finalmente y aunque para la recombinación homóloga del transgén con el DNA celular se suele emplear técnicas distintas a la microinyección, como luego veremos, desde hace unos años se pueden utilizar extremos homólogos para favorecer dicha recombinación.

En cualquier caso, mediante los procesos de biología molecular y clonación estudiados en el capítulo anterior (construcción de librerías génicas, identificación del fragmento de DNA deseado, técnicas de PCR, secuenciación nucleotídica, inserción en un vector adecuado, crecimiento y purificación del mismo) podremos obtener cantidades de DNA adecuadas para la transferencia. Mediante gradientes de cloruro de cesio (CsCl) podemos purificar el DNA plasmídico superenrollado empleado para, a continuación, separar la secuencia de DNA que vamos a microinyectar mediante enzimas de rectricción y separación en geles de agarosa. Entre los criterios para la optimización de la transferencia génica caben destacar:

·         Es indispensable que el DNA no tenga nicks o roturas de secuencia.

·         Los tampones de microinyección de baja fuerza iónica son más efectivos (10 mM Tris, pH 74, por ejemplo).

·         Las mejores concentraciones de DNA para microinyección oscilan entre 1 y 2 ng/ml.

·         Fragmentos de DNA con extremos romos se integran con menor eficiencia en el genoma celular.

·         Como ya se indicó anteriormente, inyección en el pronúcleo masculino es más efectivo que en el femenino.

·         Por último, la inyección nuclear del DNA es muchísimo más efectiva que la inyección en el citoplasma.

 

4.2 Superovulación y obtención de los embriones

Aunque se disponen de cepas de ratones muy puras, normalmente, para la transgenización se utilizan híbridos que producen embriones de mejores características genéticas. Las cepas puras suelen ser muy débiles y menos eficientes en cuanto a superovulación y capacidad de microinyección, aunque proporcionan una base genética más homogénea que los híbridos.

La superovulación se consigue mediante el suministro de dos tipos diferentes de hormonas:

1ª: La PMSG (Pregnant Mare´s Serum Gonadotropin) o la FSH (Follicle-Stimulating Hormone, en ratas y mediante implantación de minibomba osmótica). Mediante inyección intraperitoneal a hembras de entre 3-8 semanas de edad. Produce maduración de un gran número de óvulos (hasta 35 por hembra).

2ª: La HCG (Human Chorionic Gonadotropin) o la LH (Luteinizing Hormone), hacia un día después de la primera hormona. Produce la ovulación final

Con el suministro de ambos tipos de hormonas, también se consigue fotoregular el ciclo estral de los animales, haciéndolos receptivos de cara a la cópula.

Al día siguiente del cruce con los machos fértiles, aquellas hembras con tapón vaginal (proteínas coagulantes presentes en el semen del macho), indicador de la cópula, son sacrificadas. En un plazo inferior a las 8-10 horas, tiempo a partir del cual los pronúcleos acaban fusionándose, los animales son diseccionados, los oviductos (análogo a las trompas de Falopio en humanos) extraídos y, bajo la lupa, se extraen los huevos fecundados de una sección dilatada del oviducto denominada Ámpula. Finalmente, con la ayuda de la enzima Hialuronidasa, los huevos quedan libres de las células del cúmulo, independientes unos de otros y, poco después, listos para la microinyección.

 

4.3 Microinyección

Como ya se comentó anteriormente, la técnica de transferencia del material genético al núcleo de los zigotos más usual es la microinyección. Para ello se necesitan los siguientes elementos:

1.      Microscopio de micromanipulación. Tienen asociado los dos tipos de agujas que se describen más abajo, las cuales se pueden manipular manual o mecánicamente y permiten controlar bajo las lentes la manipulación de los zigotos. Estos microscopios también disponen de una placa soporte que se puede calentar a 37º para mantener los huevos en las mejores condiciones posibles.

2.      Micropipeta de sujeción. Pulida con una microforja, permite, mediante presión negativa, sostener al huevo durante la microinyección sin lisarlo.

3.      Pipeta de microinyección. Extremadamente fina y cortada con un Estirador magnético, estas pipetas se cargarán, por simple capilaridad, con el material genético, anteriormente preparado, a transferir y después serán las encargadas de penetrar hasta el pronúcleo masculino para inyectar el DNA foráneo.

Para llevar a cabo la microinyección, los huevos extraídos y tratados con hialuronidasa se depositan en un porta con una gota de aceite o parafina líquida. Bajo el microscopio y manipulando sendas agujas de sujeción y microinyección, el DNA purificado, en solución salina y cargado en la segunda aguja es introducido, en un proceso que apenas puede durar unos segundos, en el pronúcleo masculino antes de su fusión con el femenino.

La eficiencia de microinyección en ratones puede alcanzar el 90%. A partir de aquí, estos huevos empezarán su periplo de desarrollo embrionario como transgénico y tras comprobar que son viables (esperando a que pasen de estadio 1 a dos células) estarán listos para la siguiente fase.

Si la integración en el genoma de la célula microinyectada se produce antes de la fusión de los dos pronúcleos, las probabilidades de tener un transgénico puro es alta. Si no es así, se podrán obtener mosaicos, con la posibilidad de tener unos órganos y tejidos transgénicos mientras que otros no. En este último caso, sólo si el DNA microinyectado se ha integrado en la línea germinal, se podrá obtener una descendencia transgénica.

 

4.4 Reimplantación de los embriones microinyectados

Como se ha comentado anteriormente, los zigotos pueden ser rutinariamente cultivados desde un estadio de 2 células hasta blastocisto. En este punto, se pueden transferir al oviducto de una hembra pseudopreñada de día 1, o bien se pueden congelar con un crioprotector (DMSO) para una futura reimplantación.

Para conseguir hembras de ratón pseudopreñadas hay que cruzarlas con ratones estériles ya que, de otro modo, se produciría interferencia con el desarrollo posterior de los embriones transgénicos. Ratones vasectomizados se consiguen con una simple operación quirúrgica que no suele durar más allá de un par de minutos, por medio de la cual se corta y cauteriza varios milímetros de los dos conductos deferentes que transportan el semen desde cada testículo. Los ratones vasectomizados pueden cruzarse con hembras en estado proestro (una vez cada 4 días del ciclo estral de roedores). Puesto que la operación solo afecta a la producción de espermatozoides, hembras copuladas pueden desarrollar placa vaginal. Con este acto se consigue preparar hormonalmente a la hembra receptora de los embriones microinyectados para su implante en el útero y para conseguir un desarrollo embrionario completo.

La reimplantación de embriones se realiza mediante anestesia total, en un proceso que dura unos minutos, bajo la lupa. Durante este proceso, la entrada al oviducto de la hembra (infundíbulo) se hace visible quirúrgicamente. Con una pipeta fina podremos introducir dentro del ámpula hasta un total de 30 huevos que, si todo ha ido correctamente, tras una gestación normal de 21 días producirán la progenie susceptible de ser transgénica.

 

4.5 Análisis de la progenie transgénica

Una vez obtenida la nueva progenie animal, hay que analizar si la integración del DNA microinyectado ha sido un éxito y, en este caso, si hemos obtenido un mosaico o transgénico puro. El porcentaje de ratones que resultan transgénicos en cada proceso no suele ser demasiado elevado (no suele llegar al 20% de éxito). Los procedimientos de análisis más utilizados son:

·         Corte de un fragmento de la cola del ratón a las 3 semanas de vida para extraer el DNA y, mediante las técnicas de biología molecular que se mencionan a continuación, analizar la integración del transgén:

o        Southern blot: Tras purificar, separar el DNA total en un gel de agarosa y transferirlo a un filtro de nitrocelulosa, se hibrida dicho DNA con una sonda marcada que reconocerá la secuencia del transgén, produciendo una banda característica.

o        Slot o Dot blot: Parecido al Southern, pero mediante diluciones seriadas del DNA a hibridar, permite una mayor cuantificación de la cantidad de copias del transgén integradas en el genoma celular.

o        PCR: Método cada vez más utilizado para analizar la integración y cuantificación del transgén en diferentes tejidos. Es rápido pero puede introducir muchos contaminantes y falsos positivos. Hacen falta cebadores apropiados.

·         Mediante biopsias de diferentes tejidos y técnicas tales como inmunoprecipitación, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, Western blotting o tinción con diferentes colorantes, podremos analizar la expresión génica y la localización de las proteínas (si la hubiera) fruto de dicha expresión.

·         Otros estudios, tales como desarrollo del animal o conducta nos pueden dar idea del proceso de transgenización realizado.

Finalmente y mediante cruces con otros ratones, transgénicos o no podremos establecer la definitiva línea homo o heterocigótica. Dicha línea consiste en una variante de especie nueva y que, cada vez con más frecuencia y dependiendo de la importancia científica o económica-social, puede llegar a ser patentada.

 

5. TRANSFERENCIA GÉNICA EN CÉLULAS EMBRIONARIAS PLURIPOTENCIALES (ES: EMBRYONIC STEM CELLS)

Las células ES suelen derivar de la masa interna de blastocistos de 3.5-6 días post-coito. Estas células se pueden mantener en cultivo mediante inhibidores de la diferenciación (creciéndolas sobre una capa de fibroblastos embriónicos murinos irradiados que, aunque no crecen, aportan diferentes factores, o con el factor inhibitorio de leucemias). Para evitar acumulación de mutaciones, las ES no deberían mantenerse en cultivo más de unas pocas semanas antes de la manipulación.

Las primeras líneas de células ES fueron obtenidas en 1981 por Evans, Kaufman y Martin. Estas células tienen una morfología pequeña, son células agregadas y no polarizadas, creciendo como islotes sobre las células fibroblásticas. Tienen un núcleo y nucleolo grandes y una gran actividad de síntesis de proteínas. Las células ES son motivo de intensos estudios actualmente debido a que, en ausencia de inhibidores de diferenciación, pueden originar "en cultivos" diferentes tejidos (estructuras epiteliales, musculares o nerviosas). Por otra parte, cuando células ES son reinyectadas en un blastocisto, pueden colonizar todo el desarrollo embrionario y acabar constituyendo parte del tejido adulto, incluida la línea germinal. Este último aspecto las hace idóneas para la transferencia génica como proceso alternativo a la microinyección.

Mediante procedimientos rutinarios de transfección, como precipitación con fosfato cálcico o electroporación, hasta infección con retrovirus, se puede conseguir introducir material genético foráneo en el interior de células ES. No obstante, si se quiere controlar la integración del DNA en el genoma celular, es la electroporación (abre poros en la membrana celular mediante pulsos de un campo eléctrico) la técnica más utilizada actualmente.

Mediante esta técnica, podemos conseguir recombinación homóloga del transgén con el genoma celular. De hecho, podemos conseguir introducir un gen nuevo o bien sustituir uno ya existente por otro mutado, consiguiendo la pérdida funcional de dicho gen. En este último caso, obtendremos animales con una posible deficiencia genética. Estos animales se denominan "Knock-out". Una valiosa utilidad de los ratones Knock-out es la posibilidad de hacerlos transgénicos posteriormente con la expresión de algún gen de otra especie con gran homología con el gen endógeno.

Una vez seleccionadas las células ES modificadas genéticamente, podemos volver a introducirlas en un blastocisto y de aquí al útero de una hembra pseudopreñada, la cual, normalmente es de color diferente que la hembra donadora del blastocisto, para poder diferenciar fácilmente a la progenie transgénica. Dicha progenie debe volver a ser analizada para ver si estamos ante quimeras, con diferente expresión según tejidos, y, tras cruces entre hermanos, acabar obteniendo una línea transgénica homocigótica.

 

6. TRANSFERENCIA GÉNICA MEDIADA POR RETROVIRUS

Aunque se pueden utilizar otros virus, como HSV, para introducir material genético exógeno, es el retrovirus el que alcanza una eficiencia próxima al 100%. Retrovirus recombinantes se vienen empleando como una vía bastante segura para la transferencia génica desde la década de los 80, al principio en protocolos de terapia génica, pero cada vez más como vector de transgenización. Uno de los retrovirus más utilizados es el de la leucemia murina (MuLV).

El virus a utilizar puede ser recombinante y solo puede integrar una copia de DNA por célula. Dicha integración génica puede realizarse al azar utilizando los extremos LTR viral. De hecho, esta técnica se suele utilizar para producir mutaciones por inserción al azar. Un virus recombinante necesita unos cultivos celulares especiales, denominados "células empaquetadoras" para poder formar partículas virales recombinantes viables.

Para la transgenización, embriones desde 4-16 células pueden ser infectados con el retrovirus. Normalmente, los embriones de unos 2 días post-coito se cultivan sobre unas placas con fibroblastos productores de virus. Este embrión infectado volverá a ser transferido a una hembra y el resto del proceso es similar al descrito en el apartado anterior.

 

En la tabla resumen siguiente puede observarse las diferencias más notables entre los 3 métodos de transferencia génica estudiados:

 

DNA vector

 

Introducción del DNA

 

Estadio embrionario

 

Transferencia del embrión

 

Nº de copias de DNA integradas

 

Porcentaje de éxito

 

Integración

 

Desventajas

Microinyección

Cualquier tipo de DNA clonado

 

Microinyección

 

Monocelular

 

Oviducto

 

1-200

 

 

10-30

 

Al azar

 

a.       Daño físico durante microinyección

b.      Integración multicopia

c.       No se produce recombinación homóloga

Infección retroviral

Retrovirus recombinante o no

 

Infección tras remover la zona pelúcida

 

4-16 células

 

Útero

 

1

 

 

5-40

 

Normalmente al azar a través de las LTRs

 

a.       Bajo nivel de expresión

 

 

 

Células ES

DNA clonado o retrovirus

 

Electroporación o infección retroviral

 

ES Totipotentes

 

En el blastocisto y de aquí al útero

 

Varía según método de introducir DNA

 

Hasta el 100

 

Depende del método de introducir el DNA

 

a.       Dificultad de conseguir buenos cultivos celulares

 

 

7. NOMENCLATURA PARA RATONES TRANSGÉNICOS

La nomenclatura recomendada para ratones transgénicos es la siguiente:

TgX(YYYYYY)#####Zzz

TgX: indica el modo de inserción del DNA (N para inserción no homóloga, R para inserción con vector retroviral y H para recombinación homóloga).

(YYYYYY): designación de inserto, indicando las características más notables del transgén.

#####: es el número asignado del laboratorio. Número único que el laboratorio asigna a cada línea donde la inserción ha sido confirmada.

Zzz: código del laboratorio. Único para cada laboratorio y otorgado por un organismo internacional (ILAR: Institute of Laboratory Animal Resources).

 

8. TRANSFERENCIA GÉNICA EN PLANTAS

La tecnología del DNA recombinante promete cambios revolucionarios en las mejoras de manipulación de plantas. Es posible transformar células vegetales con DNA libre, bien por electroporación o por el método del disparador de partículas (pequeño cilindro de acero que contiene una carga de pólvora, a modo de microproyectil, que se usa para disparar sobre las células dianas esférulas de tungsteno de una micra revestidas con DNA), que atraviesa tanto la pared celular como las membranas sin provocar mucho daño celular. También se puede insertar directamente DNA foráneo en las células vegetales por medio de la bacteria Agrobacterium tumefaciens. De hecho, este último procedimiento suele ser el más utilizado. Este organismo, que se encuentra en el suelo normalmente, puede infectar plantas causando la enfermedad llamada "agalla de la corona" al transferir genes específicos productores del tumor.

Agrobacterium tumefaciens contiene un plásmido denominado plásmido Ti (tumour inducing), que es responsable de su virulencia. El plásmido contiene genes y un segmento de 20 kb denominado T-DNA (DNA transferido) involucrados en la transferencia de DNA a la planta.

Para la elaboración de una planta transgénica se construye un plásmido "binario", con los orígenes de replicación de las bacterias E. coli y A. tumefaciens, genes de resistencia a antibióticos, para seguir su crecimiento, y el segmento de DNA que vamos a querer introducir en la planta, flanqueado por los segmentos T-DNA del plásmido Ti. Este plásmido puede crecerse en E. coli y transferirse por conjugación a A. tumefaciens, donde se encuentra el plásmido Ti que colaborará con la transferencia de nuestro DNA a la planta, pero que, por ingeniería genética, se han eliminado los genes claves causantes de la enfermedad en la planta. El DNA foráneo puede recombinarse e integrarse en el genoma vegetal y puede expresarse confiriendo nuevas propiedades a la planta.

En la transgenización con plantas, la mayoría de los éxitos proceden de herbáceas (dicotiledóneas) como el tomate, la patata, el tabaco, la soja, la alfalfa y el algodón. Para gramíneas (monocotiledóneas) se pueden utilizar los métodos de electroporación, tras eliminar la pared celular y obtener protoplastos, o bombardeo con partículas.

Actualmente se están haciendo ensayos tímidos para dirigir mutaciones en plantas a través de transposones y obtener transgénicos sin tener que recurrir a bacterias patógenas para la planta.

 

9. BIBLIOGRAFÍA

            9.1 Libros y Revisiones:

·         Hogan, B., Beddington, R., Costantini, F. & Lacy,E.: Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor. Second Edition. Laboratory Press, New York (1994).

·         Houdebine, L.M. (ed): Transgenic animals. Generation and use. Harwood academic publishers. (1997).

·         Joyner, A.L., (ed.): Gene Targeting, A Practical Approach. IRL. Press at Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo (1993).

·         Madigan, Martinko y Parker: Brock. Biología de los microorganismos.. Octava edición. Prentice Hall. Pp383-392. (1997).

·         Markie, D. (ed): YAC protocols. Methods in Molecular Biology. 54. Humana Press. Totowa, New Jersey. (1995).

·         Monastersky, G.M. and Robl, J.M. (ed): Strategies in transgenic animal science, ASM Press. (1995).

·         Palmiter, R.D., Brinster, R.L., Hammer, R.E., Trumbauer, M.E., Rosenfeld, M.G., Birnberg, N.C. and Evans, R.M.: Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth. Nature. Vol 300 pp16-22. (1982).

·         Pinkert, C.A. (ed): Transgenic animal Technology. A laboratory handbook. Academic Press. (1994).

·         Stryer, L. (ed): Bioquímica, 4ª edición. Editorial Reverté, S.A. (1995).

·         Torres, R. and Kühn, R.: Laboratory protocols for conditional gene targeting. Oxford University Press. (1997)

 

9.2 Páginas web relacionadas:

http://www.med.umich.edu/tamc/protocols.html

http://www.cnb.uam.es/~transimp/

http://www.embl-heidelberg.de/ExternalInfo/transgenicService/

http://smwww1.med.ic.ac.uk/db/dbbm/tgunit.htm

http://ourworld.compuserve.com/homepages/thebroons/

http://www.mdanderson.org/~transgen/tcf.html

http://www.med.virginia.edu/medicine/inter-dis/transgenic-mouse/

http://www.cnb.uam.es/~transimp/Areces2000.html (Simposio Ramón Areces)

http://www.cnb.uam.es/~transimp/leyes.html (leyes)

http://www.weweb.com/cigb/plant/ (plantas)

 

 

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