MÁSTER DE
MICROBIOLOGÍA
PRÁCTICAS DE
VIROLOGÍA
DEPARTAMENTO
DE BIOLOGÍA MOLECULAR
UNIVERSIDAD
AUTÓNOMA DE MADRID
CURSO
2008/2009
NORMAS DE SEGURIDAD BIOLOGICA
Presentación por
el Instructor
- Recordar los grados de peligrosidad biológica
- Distintos niveles de seguridad.
- Tipos de
precauciones en cultivos.
NORMAS
- Está prohibido comer, beber o fumar en los laboratorios de cultivos.
- Está prohibido pipetear con la boca.
- Es obligatorio el uso de bata.
- Es obligatorio lavarse las manos antes de empezar el experimento con
el material biológico (evita contaminaciones) y cuando se sale
del laboratorio.
- Todo el material biológico (células y virus, y en especial estos últimos)
debe inactivarse con lejía antes de tirarlo.
- Los cultivos celulares no infectados por virus deberán manipularse en
las mismas condiciones de seguridad que aquellos infectados.
- Se debe trabajar siempre con material estéril (puntas, botellas,...).
- La mesa se descontaminará antes y después del trabajo experimental. El
material biológico derramado debe ser inactivado inmediatamente con
hipoclorito.
- A falta de cabinas de seguridad biológica para todos, se deberá trabajar
siempre cerca de la llama.
PROCESAMIENTO DEL MATERIAL Y LIMPIEZA
- Vasos de
precipitado grandes con hipoclorito (lejía).
- Todo material que haya estado en contacto con células o virus se debe
retirar añadiéndole lejía, y poniéndolo en la zona de material sucio.
- Luz ultravioleta al final del día.
- TODOS LOS DÍAS, al terminar la
práctica, se debe cambiar el papel de filtro, limpiar la mesa con lejía y
etanol, y colocar papeles nuevos. Así se conseguirá tener un ambiente más
propicio para empezar la práctica al día siguiente.
- Lavarse las manos con jabón a menudo. Y, por supuesto, al final de cada día
de prácticas.
PRÁCTICAS DE VIROLOGÍA
Título de
las prácticas
1.- Pases y siembras de células animales.
Recuentos.
2.- Inoculación con virus. El efecto
citopático (ECP).
3.- Inhibición del ECP por antivirales.
4.- Valoración de virus por formación de
placas de lisis.
5.- Localización subcelular de antígenos
virales por inmunofluorescencia.
6. Diagnóstico de virus por ELISA.
El guión debe ser completado por cada alumno.
Plan de
trabajo experimental.
Lunes Práctica
1: Sembrar las células para las prácticas 2, 3, 4 y 5
Martes Prácticas 2, 3 y 5: Infectar
Miércoles Prácticas 2, 3: Ver el efecto citopático
4: Hacer diluciones e Infectar
5: Fijar las monocapas
Jueves Práctica 5: hacer la
inmunofluorescencia
Practica 6: realizar el ELISA
Viernes Práctica 4. Fijar y contar las placas de lisis
5:
Observar la inmunofluorescencia
6.
Cuantificar los resultados
Seminario: Preguntas y cuestiones
1.- Cultivo de células
animales. Siembra y pases.
Concepto: En esta práctica se procederá a sembrar las células necesarias para el
resto de los experimentos. Se manejarán dos tipos celulares que pueden crecer
en un medio de cultivo común, como es el DMEM, suplementado con suero fetal de
ternera al 5%. Estas células crecen ancladas al soporte del plástico y pueden
levantarse por tratamiento con tripsina y EDTA. En suspensión, la concentración
celular puede determinarse utilizando un hemocitómetro o cámara de recuento
Neubauer.
Objetivos: Cultivar células eucarióticas, realizar subcultivos y determinar el número
de células en una monocapa.
Reactivos, tampones
Para un
experimento
y materiales de partida
Células
HeLa (P100 confluente)
2
Placas de 6 pocillos
1
Medio + Suero
30 ml
Placa de 24 pocillos
1
Tripsina
+ EDTA
6 ml
A preparar por los profesores:
30 ml/pareja DMEM 5%
25 ml/pareja 2%
25 ml/pareja 1%
Método:
1. Resuspender
células.
- Retirar medio de
las placas (HeLa), evitando contaminaciones.
- Añadir 1 ml de
tripsina por P100, mover y retirar.
- Añadir 1 ml de
tripsina, dejar actuar hasta redondeamiento celular.
- Resuspender en 5
ml finales por P100, en medio con suero.
2. Contaje.
- Contar en cámara de Neubauer ambas suspensiones. El hemocitómetro está
dividido en nueve grandes cuadrados, a su vez cada uno subdividido en dieciséis
cuadrados pequeños.
- Generalmente se cuentan cuatro cuadrados grandes, y el valor medio
multiplicado por 104 y por el recíproco del factor de dilución, nos da el número de
células/ml en la suspensión original.
3. Siembra de células Hela.
a.
ECP y antiviral:
sembrar doce pocillos de una placa M24 con 50.000 células cada uno, en 0.5 ml de medio.
b.
PFU: sembrar 1 placa de 6 pocillos con 4
x 105 células por pocillo en 2ml.
c.
Inmunofluorescencia: sembrar 1 placa
P60 sobre cubres con 5 x 105 células en 5 ml.
Las placas deben quedar marcadas con el tipo de célula,
el número de pase, la fecha y el nombre del subgrupo.
Resultados
Dibujar la cámara de Neubauer y detallar cómo se calcula la concentración
celular, en células/ml, de las muestras a partir de los contajes efectuados al
microscopio. Anotar:
Tipo celular Nº
Recuento
Células/ml
______________________________________________________________________________
HeLa
______________________________________________________________________________
A partir de estos datos,
calcular el volumen que se ha de sembrar en cada una de las placas para
cultivar el número de células que se indica en el apartado de Método, e
indicarlo en la siguiente tabla:
Tipo celular ml/P6 ml/P60 ml/M24
HeLa
Cuestiones
1. ¿Cuál es la función de la
tripsina en el método? ¿Es necesario siempre su uso en cualquier línea celular?
2. ¿Por qué en el incubador
hay una atmósfera de C02 y humedad controladas?
3. ¿Cómo
calcularías el tiempo de duplicación de estas células? ¿Te atreverías a estimar
su duración aproximada?
2.- El efecto citopático
por infección viral
Concepto: Los virus necesitan entrar en la célula
y utilizar su maquinaria de síntesis de macromoléculas y fuentes energéticas
para replicarse, siendo incapaces de hacerlo por sí solos. Los efectos dañinos
de la replicación viral en la célula son una de las causas básicas de las
enfermedades virales. La infección viral puede llevar a varios resultados posibles, dependiendo de la
naturaleza de la infección entre el virus y la célula:
- Infección
no productiva: La replicación viral está bloqueada y la célula puede sobrevivir
o no.
- Infección
productiva: la célula lisa.
- Infección
persistente: la célula puede sobrevivir y continúa produciendo virus a bajo
nivel.
Una de las formas clásicas para detectar la replicación viral en las
células es la observación de cambios en la estructura celular o Efecto
Citopático (ECP). Algunos de los efectos más comunes en la infección viral son
cambios morfológicos tales como:
- Redondeamiento
de la célula y desprendimiento de la placa (en el caso de células adherentes).
- Lisis
celular.
- Formación
de cuerpos de inclusión.
Muchos de los cambios morfológicos (ECP) pueden ser
efectos secundarios producidos en la célula por la necesidad del virus para
replicarse, pudiendo no ser efectos tóxicos producidos por productos virales
contra la célula. Sin embargo, hay algunos productos génicos virales que causan
efectos tóxicos per sé en la célula
aunque se desconozca aún su mecanismo molecular. Así, debido al efecto
citopático causado por los virus citolíticos, la simple observación al
microscopio óptico de la monocapa celular nos permite determinar si la
infección viral se está desarrollando.
Objetivos: Visualizar y cuantificar el efecto citopático producido por la infección
del virus de la Estomatitis Vesicular en células HeLa.
Reactivos y Tampones
Para un experimento
Células
HeLa sembradas,
18
pocillos
105 células/pocillo
.
Preparado de virus VSV con
106 PFU
título 108 UFP/ml
Medio + Suero 21 ml
Método
Vamos a infectar a baja
multiplicidad de infección (MDI ó UFP/célula) una monocapa de células
susceptibles al virus VSV. Como el ciclo vital del virus tiene un tiempo de
duración de 8 horas, esperamos dos ciclos al menos antes de leer los resultados
y determinar el número de células en la monocapa.
Pasos a seguir:
1. Retirar
medio de las placas.
2. Añadir
el virus VSV a una MDI de 0.5 y 0.05
unidades formadoras de placas (UFP) por célula en 0.2 ml de medio con 1% de suero. Este es el volumen por
pocillo que se debe infectar.
3. Poner
en el incubador y agitar cada 15 min. durante una hora.
4. Retirar
los inóculos. Añadir 1 ml de medio con 2% de FCS. Incubar 24 horas.
Prácticas 2 y 3
|
SD- |
C- |
C- |
0.05 |
0.05 |
0.5 |
0.5 |
|
SD50 |
C- |
C- |
0.05 |
0.05 |
0.5 |
0.5 |
|
SD500 |
C- |
C- |
0.05 |
0.05 |
0.5 |
0.5 |
Resultados
Observar al microscopio. Anotar si el aspecto de las monocapas celulares es
comparable o son distintos. Cuantificar el ECP según la escala siguiente: +++
100% de destrucción de la monocapa; ++ 75%; + 50%; +- 25%; - 0%.
Dibujar toda la placa, indicando los resultados obtenidos.
CUESTIONES
1.- ¿Por qué el
número de células es inferior en la placa infectada?.
2.-
¿Obtendríamos el mismo resultado en otro sistema virus - célula?.
3.- ¿Qué otro
procedimiento sugieres para determinar la infectividad de un virus?.
3. Inhibición del efecto
citopático por antivirales.
Concepto: El control de las infecciones virales
exige la utilización de medidas profilácticas y medidas terapéuticas. Entre las
medidas profilácticas, las vacunas han demostrado ser una buena herramienta en
el caso de algunos virus. Sin embargo la carencia de una profilaxis eficaz
exige la disponibilidad de agentes antivirales cuya actividad esté
perfectamente caracterizada y no presente toxicidad para el paciente. Un agente
antiviral debe cumplir varios requisitos:
- El compuesto debe ser soluble en
agua, apolar y capaz de entrar en la célula infectada
- La concentración efectiva del compuesto
en la reducción del crecimiento viral no puede tener actividad
citotóxica, citostática ni inmunosupresora
- El efecto del
compuesto debe ser específico para el virus y en ningún caso debe tener capacidad
mutagénica
- El índice
antiviral (el cociente entre la concentración mínima citotóxica y la
concentración mínima efectiva) debe ser superior a 100 en ensayos in vitro
y a 10 en ensayos in vivo.
Sin embargo, ninguno de los antivirales encontrados hasta el momento posee
todas las características mencionadas. Esto ha motivado la restricción de la
utilización de drogas con actividad antiviral en clínica.
Los cultivos celulares constituyen un modelo muy apropiado para la
selección y el estudio del mecanismo de acción antiviral de nuevos inhibidores.
Existe una enorme variedad de ensayos para determinar de forma más o menos
rutinaria la actividad antiviral de compuestos entre los que podemos destacar:
- Cuantificación del porcentaje de células no infectadas: Ensayo de
protección de ECP y ensayo de reducción de placas de lisis
- Cuantificación
de la inhibición de actividad metabólica celular, mediante la determinación de
la síntesis de macromoléculas celulares
- Cuantificación de la actividad metabólica del virus: Ensayos de ELISA,
Hibridación del ácido nucleico de la célula infectada con sondas virales etc.
Polisacáridos
Naturales
Los polisacáridos sulfatados, entre los que se encuentra el Dextran Sulfato
(que utilizaremos en esta práctica) son compuestos naturales que producen una
fuerte inhibición de la replicación de un gran número de especies virales, como
el Herpes y el VIH. El mecanismo de acción de los polisacáridos sulfatados
parece afectar a un paso temprano de la infección viral. Se han descrito casos
en los que se inhibe la adsorción del virus a la célula. Sin embargo, también
se ha observado la entrada de Herpesvirus a la célula tratada con este
antiviral, encontrando la inhibición en un paso inmediatamente posterior.
Los
Interferones
Los interferones son una familia multigénica de proteínas reguladoras que
se sintetizan sólo como respuesta a una gran variedad de estímulos externos.
Estas moléculas presentan diversos efectos biológicos, entre los que cabe
destacar su actividad antiviral y antitumoral. Los interferones pueden
englobarse dentro de una familia más amplia de proteínas: las citoquinas,
moléculas que sirven para enviar señales a otras células. El IFN humano está
clasificado en varios tipos antigénicamente distintos, el IFN a, b, g, principalmente.
Desde el descubrimiento del IFN a finales de la década de
los 50 y sobretodo desde su clonado y producción en cantidades suficientes, los
esfuerzos de los investigadores se centraron en esclarecer el mecanismo por el
cual el IFN es capaz de establecer en la célula un estado antiviral. Sin embargo, todavía no se conoce bien dicho
mecanismo, aunque parece claro que debe de actuar más de un mecanismo para
promover dichos efectos. El estudio en cultivos celulares del efecto del IFN
sobre los distintos virus, ha demostrado que la respuesta varía según el
sistema virus-célula empleado. Así, dependiendo del ciclo de replicación del
virus, del tipo de IFN utilizado y de la interacción virus- célula, el efecto
del IFN puede ser sobre un paso temprano o tardío del ciclo de infección o bien
el virus puede escapar o destruir el estado antiviral.
Objetivos: Visualizar y valorar cuantitativamente la
inhibición en el efecto citopático y propagación viral que produce el antiviral
Sulfato de Dextrano in vitro.
Reactivos, tampones y materiales
Los
mismos que en la Práctica 2.
Sulfato
de dextrano 2 mg/ml.
Método
A)
Sulfato de dextrano:
- Varios pocillos de M24 se infectan con VSV a MOI 0.5, varios
a MOI 0.05, y otros tantos se dejan como control sin infectar.
- Añadir en el medio, después de la adsorción viral, 50 y 500 mg/ml final de Sulfato de Dextrano, en pocillos
infectados y controles. Incubar 24 horas.
Resultados
Observar
la morfología de las células y obtener los datos como en la práctica anterior.
De la
práctica en que se titulan estas muestras, calcular el grado de inhibición
producido por el antiviral.
CUESTIONES
1.- ¿Habríamos
obtenido el mismo resultado si este antiviral se hubiese utilizado en la
infección con otro virus?
2.- ¿Se
observa efecto tóxico del antiviral en las células no infectadas?
4.- Valoración de virus animales por formación de placas
de lisis.
Concepto: La presencia de
los virus se reconoce por la manifestación de alguna anormalidad en los
organismos o células del huésped. En cultivos celulares, los síntomas de la
infección viral varían desde cambios morfológicos y de crecimiento hasta
efectos citopáticos tales como redondeamiento celular, rotura celular,
desarrollo de inclusiones, formación de sincitios y lisis. Los virus pueden
contarse por ensayos basados en su capacidad de infectar, multiplicarse y
producir progenie capaz de causar efectos citopáticos visibles, esto es, en
unidades infecciosas. La estimación del número de virus o unidades infecciosas
por unidad de volumen se conoce con el nombre de titulación.
Para titular un virus, primero hay que definir muy bien
las lesiones que produce. Estas lesiones pueden ser: lisis, fusión,
agigantamiento, proliferación celular, etc. En el método de las unidades
formadoras de placa (UFP), varias monocapas celulares se infectan con diluciones
seriadas de la suspensión del virus. Después de una o dos horas se cubre la
monocapa con un medio semisólido. Allí donde un virus ha infectado a una
célula, aparece al cabo de 2-3 ciclos de infección una placa visible,
resultante de la infección de las células adyacentes a la inicialmente
infectada. El medio semisólido evita que las nuevas partículas virales se
difundan por toda la monocapa. El requisito para que el método funcione es que
las células infectadas deben poderse distinguir claramente de las no
infectadas. El método más usado suele ser teñir la monocapa con un colorante
citológico inespecífico, o bien usar rojo neutro como colorante vital. De esta
forma las placas podrán contarse fácilmente y el título se expresará en unidades formadoras de placa por mililitro
(UFP/ml). Existe una relación directa entre el número de virus en una
suspensión inicial y el número de placas resultante.
Objetivos: Cuantificar el número de unidades
formadoras de placas de lisis por ml de un pocillo de la práctica anterior
infectado con VSV y otro donde sea menor el ECP.
Reactivos y tampones
Para un
experimento
Placas
P6 con una monocapa
1
de
células HeLa
Medio +
suero
20 ml
PBS
10
ml
Agar
Formaldehído 10%, cristal
violeta (2% en formaldehído 10%).
Una
placa no se infecta y se lleva como control. Las otras placas se inoculan con
las diluciones de virus. Pasos a seguir:
1. Hacer
diluciones hasta 10-6 de virus control y 10-5 de virus
tratado con antiviral en medio con 1% de suero.
2. Retirar
el medio de las placas y lavar con 0.5 ml del mismo medio.
3. Inocular con 1 ml por pocillo de
las diluciones 10-4, 10-5, 10-6 de VSV control y con 10-4 y 10-5 de VSV tratado con antiviral.
4. Poner
en el incubador y agitar cada 15 min. durante una hora.
5. Retirar
el inóculo y añadir 2 ml por pocillo de
medio con suero y agar, previamente estabilizado a 50ºC.
6. Incubar
48 horas.
7. Añadir
2 ml de formaldehído 10% sobre el agar, esperar 15 min.
8. Levantar
el agar con cuidado y teñir 15 min. con cristal violeta.
9.
Recuperar el colorante. Lavar las
placas con agua.
Resultados
UFP
UFP/ml
Sin infectar
+ VSV
+ Antiviral
+ VSV
Tener
en cuenta en los cálculos las diluciones de partida.
CUESTIONES
1.- ¿Daría el mismo título si se emplease otro tipo celular como
monocapa indicadora?
2.- ¿Son infecciosos todos los virus
en el preparado?
3.- ¿Es suficiente una hora de adsorción?
4.- ¿Son todas las placas de lisis idénticas?. ¿Qué parámetros
podrían afectar a su tamaño?
5.- ¿Cómo titularías un virus que infectase células no
adherentes?.
5. Localización subcelular y ensamblaje de proteínas virales
Concepto: Anticuerpos
contra proteínas que forman las cápsidas de los virus, pueden permitir
localizar dentro de la célula los lugares de acumulación y el ensamblaje de las
partículas virales .
Objetivo: Observar la
síntesis de proteínas de la cápsida del parvovirus MVM y el compartimiento
celular donde se produce la formación de las cápsidas, con anticuerpos
específicos e inmunofluorescencia.
Reactivos y tampones
Por experimento
Antisuero anti MVM 0.02 ml de 1/100
Monoclonal anti-MVM
0.02 ml de
1/100
Virus MVM
0.2ml
Celulas Hela
Método
Sembrar Hela en P60 sobre cubres
Pasar cubres a M24 e inocular con MVM
Fijar los cubres con metanol-acetona
Realizar Inmunofluorescencia
Visualizar proteínas y cápsdas de MVM al microscopio
Resultados
6. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Posible detección de antígenos virales.
Conceptos: La
técnica inmunológica denominada ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
es un poderoso test, basado en el uso de anticuerpos, que se emplea para
detectar agentes patógenos que provocan enfermedades como el SIDA y el SARS, o
para buscar trazas de patógenos en el agua, en alimentos, o en el aire, cuando
aparezcan estos agentes de forma natural o como consecuencia de contaminación
intencionada de estos medios. La técnica ELISA también se utiliza para
identificar organismos genéticamente modificados (GMOs), o para rastrear la presencia
de alergenos alimentarios, marcadores moleculares de embarazos, o de
drogadicción, etc.
Mediante el uso de anticuerpos específicos podemos reconocer posibles antígenos
procedentes de organismos patógenos con una altísima especificidad. Como balas
mágicas, los anticuerpos localizan y se pegan a las moléculas diana. Al pegarse
a estas moléculas foráneas, los anticuerpos los convierten en reconocibles para
las células del sistema inmune. Los anticuerpos constituyen una herramienta muy
útil y por ello se usan en biotecnología y en diagnóstico de enfermedades y su
tratamiento.
Para la siguiente práctica, vamos a utilizar un Kit comercial especialmente diseñado para la rápida detección de un antígeno extraño. En nuestro caso, vamos a simular la detección de un antígeno viral, tal y como podría llevarse a cabo en cualquier procedimiento de diagnóstico clínico. La técnica del ELISA admite diferentes variantes: identificar un antígeno dado o identificar la presencia de anticuerpos específicos contra un antígeno dado. Utilizar diferentes reactivos de detección del ensayo, como fosfatasa alcalina o peroxidasa.
Por tratarse de un Kit ya preparado, simplemente se procederá a seguir detalladamente las instrucciones dadas por la casa suministradora.
Objetivos didácticos:
Vídeo demostrativo:
http://www.bio-rad.com/LifeScience/jobs/2004/04-0522/04-0522_ELISA.html
Ag: Proteína viral
en suero
1er Ac:
Anti-proteína de la cápsida
(Policlonal.
Conejo)
2º Ac: Conejo
anti-Ratón IgG-HRP (HRP: HorseRadish Peroxidase ó Peroxidasa de rábano picante)
(Policlonal.
Cabra)-HRP
Sustrato HRP: TMB (TMB: 3,3’,5,5’-TetraMethylBenzidine)
Lectura a 655 nm
Resultados
Mediante un sistema rudimentario
de cruces (-, +/-, +, ++/-, ++, +++/-, +++) representa tus resultados a continuación.
CUESTIONES
1.- ¿Cómo tendríamos que haber procedido para detectar antígenos en
vez de anticuerpos?
2.- Si trabajaras en un hospital ¿Se te ocurre algún test extra
antes de decirle, por ejemplo, a un paciente que tiene una infección viral?
3.- ¿Consideras que la técnica es cualitativa o cuantitativa?
4.- Explica la finalidad de cada uno de los controles utilizados. ¿Por qué hacer el experimento por triplicado?
FOTOS CURSO 2008-09
Todos felices. De momento...
