MASTER BIOTECNOLOGÍA CBMSO-UAM 2002
INMUNOLOGÍA
PROGRAMA RESUMIDO:
- Crecimiento (congelación y descongelación) de diferentes líneas celulares: Líneas celulares humanas y murinas. Productoras o no de anticuerpos. Monocíticas con capacidad de diferenciación a estadios macrofágicos.
- Obtención de anticuerpos monoclonales: Inmunizar ratones con cápsidas del virus MVM. Fusión con un mieloma (X6) de ratón. Crecimiento en placas multipocillos M-96. Selección con HAT. Caracterización y obtención de clones productores de anticuerpo. Crecimiento con Feeder Layer y medios condicionados. Selección por dilución límite...
- Obtención y purificación de sobrenadantes de hibridomas y Ascites: Hibridomas productores de anticuerpos anti-TNF y anti-TfR. Utilización de este sobrenadante para inmunoprecipitación, inmunoblotting o ELISA. Inducción de ascites con Pristano ó AIF.
- Inmunodifusión: Tanto doble bidimensional, simple radial o electroinmunodifusión, para caracterizar un pool de antígenos y anticuerpos. Determinación de antígenos problemas y sus concentraciones.
- Microscopía de fluorescencia: Con anticuerpos marcados con fluorógenos de diferentes colores. Tanto microscopía convencional como Confocal, para colocalización de diferentes antígenos en el interior celular.
- Microscopía electrónica: Marcaje de anticuerpos con oro coloidal para inmunoelectromicroscopía.
- Citofluorimetría: Detección de antígenos de diferenciación monocítica en la superficie celular. Modulación de dichos antígenos durante la maduración y diferenciación celular.
- Purificación y caracterización de anticuerpos según su isotipo: Tanto de forma automática (amersham) como manual con diferentes columnas con proteína A ó G unida a Sefarosa, que diferencia el isotipo IgG3 del resto...
- Infecciones con virus animal e inhibición por anticuerpo: Se caracterizará la infección "per sé". Se estudia cómo anticuerpos contra cápsida viral inhibe la infección, producción de progenie viral y síntesis diferencial de proteínas en células infectadas.
- Hemaglutinación: Tanto en humanos (análisis de grupo sanguíneo) como la producida por algunos virus. También se analizará la inhibición producida por anticuerpos contra el virus.
- Obtención de mAc: La inmunización de algunos de los ratones resultó un éxito (comprobado mediante ELISA del suero animal). A decir verdad, en otro de los "individuos", se obtuvo, durante la obtención del bazo y timo, un producto lechoso inesperado. Este ratón sufrió una pobre inmunización. Además, muchos de los "pocillos" de una M-96, durante el proceso de selección de hibridomas, acabó contaminándose. Las prácticas terminaron (3 semanas de duración) sin que se pudieran aislar clones productores de mAc individuales. El proceso continuará en un laboratorio interesado por MVM.
- Confocal, Electromicroscopía, Purificación automática de IgG: Con la excepción de la última de las prácticas indicadas (algunos alumnos purificaron en columnas preempaquetadas, pero manualmente), los alumnos pudieron observar y atender a las explicaciones de los técnicos responsables de los diferentes servicios para analizar: Colocalización de diferentes antígenos, mediante microscopía confocal, en el interior celular; marcaje con Ac marcados con oro de antígenos mitocondriales y análisis mediante inmunoelectromicroscopía; Purificación de IgG de un ascites productor de mAc anti-TNF y fraccionamiento del producto Eluído para detección del pico de concentración del mAc.
- Marcaje de Ags de la superficie de monocitos: A pesar de... algún comentario... poco acertado... por parte de algún "miembro" de la comunidad científica... Esta práctica fue un rotundo éxito. Se marcaron U937, diferenciadas o macrófagos, con anti-CD71 (TfR) o anti-CD11b. Mediante citofluorimetría se observó cómo ambos antígenos eran modulados con la diferenciación celular. Se obtuvieron las gráficas y los porcentajes relativos de la expresión.
- Infección de células 4K: La línea celular humana NB324K se infectó con un virus animal para el cual era susceptible. Se observó el ECP a las 24 y 48 h p.i., el bloqueo de la infección mediante anticuerpos contra el virus y la producción de proteínas y progenie virales. Mediante IF se pudo observar "maravillosamente bien" antígenos virales en el interior celular, con marcajes con anticuerpos marcados con distintos fluorógenos. También se observó el núcleo celular mediante incorporación de DAPI.
- Inmunodifusiones: Mediante Ouchterlony (cualitativa) o Mancini (cuantitativa) se pudo observar aceptablemente la precipitación producida en agarosa de reacciones específicas de diferentes albúminas (perro, humana, gallina, oveja, vaca, cerdo) con sus respectivos anticuerpos. También se pudo determinar la concentración de una muestra problema mediante los halos observados en la inmunodifusión simple radial. Sin embargo, la caracterización del isotipo del suero de un ratón inmunizado contra virus no se pudo observar (probablemente debido a la baja concentración de antígeno y sueros comerciales...). También se pudo separar y caracterizar una muestra de suero de ratón mediante electroinmunodifusión.
- ELISAs, Westernblot, Inmunoprecipitación: A lo largo de las prácticas realizadas, estas han sido algunas de las técnicas más utilizadas para la detección de diferentes antígenos. Mediante un ELISA comercial se caracterizó el isotipo de un ascites con anticuerpos anti-TNF (salvando algún despiste del profesor y su equipo...). La inmunoprecipitación y el Western (inmunoblotting) nos ayudaron a identificar la expresión de algunas proteínas concretas en células infectadas o no. Se analizó un pool de proteínas enriquecidas con BSA, inmunoprecipitando con mAc anti-BSA. También se analizó la inducción de apoptosis en U937 y células 4K infectas con virus mediante mAc anti-PARP.
- Análisis de Apoptosis: Se estudió la muerte celular programada en U937 inducidas con TNF y CHX (Factor necrosante de tumores y cicloheximida) mediante marcaje con DAPI, observación de cuerpos apoptóticos y corte de diferentes proteínas con caspasas (PARP) y posterior Westernblot con anticuerpos apropiados. 4 h post-inducción, los monocitos mostraron condensación de la cromatina y formación de visibles cuerpos apoptóticos.
Por las limitaciones de las cabinas de flujo laminar y la necesidad de trabajar en las mejores condiciones de esterilidad (aunque los hongos han hecho aparición por todas partes...), se organizaron los alumnos en 6 grupos de trabajo multiculturales y multinacionales (qué raro suena esto último...):
- Grupo 1 (Con Elena al frente): Xime (Pamplona), Meli (Valladolid), Anita (Sevilla), Evita (Ovieu), Ritiña (Pontevedra), Márata (Madrid).
- Grupo 2 (Con Mercedes al frente): Georgina (Argentina), Cristina (Madrid), Paul (Camerún), Alfonso (Madrid), Aitor (Madrid), Mario (Madrid).
- Grupo 3 (Con Felipe al frente): Graciela (Madrid), Carolina (Colombia), María (Madrid), Javier (Madrid), Marta (Córdoba).
- Grupo 4 (Con Celia al frente): Susana (Bolivia), Raquel (Madrid), Xema (Galicia), Piti (Madrid), Rocío (Madrid), Masi (Madrid).
- Grupo 5 (Conmigo al frente, aunque poco...): Ira (USA), Marian (País Vasco), María (País Vasco), Milagros (Madrid), Marisa (Madrid), Susi (Perú)).
- Grupo 6 (Con Carlos al frente): Aurora (Granada), Alicia 1 (Madrid), Marga (Madrid), Merce (Madrid), Alicia 2 (Madrid), Eduardo (Zaragoza).
