TEMAS 8 Y 9: ALTERACIONES CELULARES TRAS LA INFECCIÓN Y QUIMIOTERAPIA ANTIVIRAL
- Los cultivos celulares siguen siendo el método más común de crecimiento y propagación de virus.
- Células epiteliales o fibroblásticas crecen hasta cubrir el plástico de cultivo (también hay cultivos en suspensión, pero menos utilizado para el estudio del ciclo celular...).
- Existen 3 tipos principales de cultivos celulares:
o Primarios: Células extraídas directamente del animal y con capacidad de división limitada. Se utilizan cuando el estado de diferenciación es importante en el estudio o cuando no existen cultivos establecidos... También se utilizan para el desarrollo de vacunas (no contaminar con DNA de células transformadas una preparación...)
o Cultivos de células diploides: Células establecidas y con mayor capacidad de división (hasta 100 pases), pero que mantienen su dotación cromosómica diploide. Son poblaciones homogéneas.
o Cultivos celulares continuos: Un único tipo celular que se propaga indefinidamente en cultivo. Son inmortales y derivan de tumores o tras mutaciones de cultivos diploides infectados con virus tumorigénicos. Estas células sufren de degeneración genética (aneuploidía).
- Cuando ciertos virus infectan cultivos celulares, se produce una serie de procesos, liberación del plástico, por ejemplo, que culminan en el denominado EFECTO CITOPÁTICO.
- Los cambios empiezan a ser visibles poco después de la infección, dependiendo del virus y del tamaño del inóculo:
§ Polio, en pocas horas tras la infección.
§
HSV: de uno
a varios días.
-
Como ejemplo, poliovirus induce ECP en líneas celulares neuronales. La
lisis de neuronas por el virus en el SNC produce parálisis (poliomielitis).
-
Muchas características se hacen evidentes incluso con microscopía de
fase y sin fijación celular:
o
Redondeamiento
celular, lisis celular, liberación del plástico, aumento del núcleo y formación
de SINCITIOS...
-
Otros cambios necesitan microscopía más potente:
o
Desarrollo
de masas de viriones en el interior, y acúmulo de componentes víricos sin
ensamblar en el núcleo y/o citoplasma (CUERPOS DE INCLUSIÓN), formación de
estructuras cristalinas de proteínas virales, Vesiculación y plegamientos de
la membrana celular, producción masiva de nuevas membranas...
-
El desarrollo del ECP se puede monitorizar in virología diagnóstica
cuando el virus es aislado de organismos infectados.
-
También es válida la observación del ECP en investigación.
-
Algunos virus infectan células sin inducir ECP obvio:
§
Algunos
virus de la familia Arenaviridae, Paramyxoviridae ó Retroviridae.
-
En estos últimos casos, el estudio de la infección debe realizarse por
otros métodos como síntesis de macromoléculas tras la infección, hibridación
de proteínas o ácidos nucéicos...
-
Una característica que se puede estudiar, con visualización o no del
ECP, es la capacidad que tienen muchos virus de inhibir de forma activa la síntesis
de macromoléculas celulares (shutoff).
-
También se inhibe el transporte vesicular, aumentando la permeabilidad
de las membranas celulares. Una consecuencia de esto sería que el contenido
lisosomal puede difundir por el citoplasma produciendo autodigestión...
-
Principalmente, son virus de ciclo rápido, aunque también se produce
con virus más complejos:
§ Poliovirus: 2A
§
HSV-1: vhs
-
Otra consecuencia de la infección viral que en los últimos años va
tomando más importancia es la inducción de APOPTOSIS:
o
Es un
proceso activo y contrario a la Necrosis.
o
Existen
varios mecanismos de inducción de apoptosis.
o
Los virus
pueden tener proteínas propias que modulan apoptosis (induciendo o
inhibiendo...)
o
Entre las
características más relevantes están:
§
Condensación
de la cromatina
§
Digestión
“en escalera” del DNA celular
§
El
contenido celular no se libera al medio. Aparecen los cuerpos apoptóticos
que engloban material celular entre membranas...
§
Activación
de enzimas específicas involucradas en apoptosis como las caspasas...
QUIMIOTERAPIA
ANTIVIRAL
-
Los virus penetran en el interior de las células y utilizan enzimas y
constituyentes celulares, por lo que la posibilidad de atacar a un virus sin dañar
las células no resulta obvia.
-
En la actualidad se emplean antivirales que alteran etapas críticas del
ciclo vital del virus con mayor o menor daño celular...
-
Sin embargo y mientras que el campo del desarrollo de terapias
antivirales avanza lentamente, el desarrollo de métodos preventivos (vacunas)
experimentó un rápido y firme avance desde mediados del siglo pasado...
-
Diversas razones para el lento desarrollo de antivirales efectivos:
o
Los efectos
sobre el organismo vistos antes
o
Un
antiviral tiene que ser efectivo 100% para poder eliminar la infección, debido
a la alta tasa de replicación vírica existente a veces
o
Muchos
virus no crecen adecuadamente en cultivos celulares
o
Muchos
virus tienen un efecto tan rápido que la terapia llega tarde...
-
El primer antiviral elaborado fue un derivado de la SULFONAMIDA (antibiótico)
a principios de los años 50.
-
Desde los años 70, se empezó con un programa de búsqueda “ciega”
de compuestos con capacidad antiviral.
-
Muchos antivirales estuvieron en el mercado años antes de conocerse su
mecanismo de acción, como por ejemplo la AMANTADINA (contra la gripe).
-
La búsqueda de agentes antivirales se puede realizar desde perspectivas
moleculares (se conoce un enzima viral y se buscan compuestos que inhiban) o
celulares (compuestos que inhiben procesos más generales...).
-
También se pueden diseñar antivirales mediante computadoras, intentando
inhibir algún componente viral concreto...
-
Características esenciales de un buen compuesto antiviral:
§
Todas
aquellas vistas en vacunas (barato, estable, fácil administración, efectos
prolongados, solubles en agua)
§
SEGUROS:
Mucho más tóxico para el virus que para la célula (índex citotóxico ó
terapéutico, según si hablamos de células o tejidos, del orden de 1/1000
como mínimo, es decir, que la dosis tóxica en el huésped sea mil veces
superior a la que inhibe la infección.
-
ALGUNOS ANTIVIRALES:
o
Aciclovir:
Muy efectivo contra HSV y virus relacionados. Es un análogo del NUCLEÓSIDO
GUANOSINA pero con un grupo azúcar acíclico. La activación del compuesto
requiere de 3 quinasas, una de ellas no está presente en células sin infectar.
HSV TK sí puede convertir la droga en un monofosfato e incorporarlo a su DNA,
pero, al faltar el extremo 3’-OH, se termina la síntesis de DNA y la
replicación del virus se bloquea.
o
Ganciclovir:
Derivado del Aciclovir empleado contra CMV.
o
Ribavirina
(Virazole): Sintetizado en 1972 como análogo de nucleósido de amplio espectro
antiviral (DNA y RNA). Es relativamente tóxico y con grandes efectos
secundarios. Su uso no está permitido en todos los países. Disminuye el pool
de GTP en la célula. También inhibe la iniciación y elongación de la RNApol
específica de virus. Se utiliza en tratamientos contra HCV.
o
Inhibidores
de Proteasas: Además de la investigación en HIV, otras proteasas virales están
siendo estudiadas como posibles dianas contra diferentes drogas: NS3 de HCV...
o
Amantadina:
Fue diseñada hace más de 30 años como antiviral específico contra influenza
A. Es una droga específica que tiene por diana la proteína M2 del virus
o
Antivirales anti-HIV:
§
Inhibidores
de la entrada viral: Derivados de CD4, Lectinas...
§
Análogos
de Nucleósidos : Zidovudina (AZT), Didanosine...
§
Inhibidores
de la Transcriptasa en reverso NO análogos de Nucleósidos: Nevirapine,
Delavirdine...
§
Inhibidores
de la Integrasa...
§
Inhibidores
de la transcripción: Inhibidores de Tat
§
Inhibidores
del ensamblaje: Inhibidores de la PROTEASA (Ritonavir, Indinavir...)
INTERFERONES
-
En 1957, Isaacs y Lindenmann descubrieron que células de pollo
infectadas con influenza producían sustancias que protegían otras células de
la infección: Interferones.
-
IFNs son producidos en Mamíferos, aves, reptiles y peces.
-
La replicación del virus no es necesaria para la inducción de los IFN...
-
Además del RNA de doble cadena, endotoxinas, actinomicina D (inhibidor
de transcripción) o cicloheximida (inhibidor de la traducción) pueden inducir
la síntesis de IFN.
-
Hay 3 clases de IFN (además de los IFNv y t,
producidos por la placenta, menos estudiados):
o
IFNa
ó b
(tipo I): Inducidos por infecciones virales de prácticamente cualquier tipo
celular.
o
IFNg
(tipo II): Inducido en linfocitos tras la activación inmunológica...
-
Las señales que originan la producción de IFN tras la infección viral
no están del todo esclarecidas.
o
Se piensa,
no obstante, que la más importante es la acumulación de dsRNA, producto
inevitable de la replicación de virus RNA y DNA. Cualquier molécula de RNA
(incluso mRNA) va a tener regiones de complementación interna. Estos dsRNA
virales son mucho más abundantes que los niveles basales normales de células
sin infectar.
o
También,
algunas proteínas estructurales virales podrían
inducir IFN
o
Otros:
Virus que directamente transcriben genes de IFN, etc...
-
En cualquier caso, la inducción de IFN es rápida: A las pocas horas de
infección y disminuye a partir de la hora 10 p.i.
-
IFN afecta a las células con receptores específicos para él:
o
La unión
de IFN a sus receptores específicos, inducen la transcripción de genes nuevos,
sin necesidad de síntesis de proteínas, que activan el estado antiviral...
o
Hay dos
tipos de receptores: Para lo que hemos denominado IFN tipo I y otro diferente
para el IFNg.
-
ESTADO ANTIVIRAL:
o
No todos
los virus son sensibles al IFN (curiosamente, Influenza es bastante
resistente...).
o
El ESTADO
ANTIVIRAL puede inducir la activación de hasta más de 100 genes.
o
En general,
proteínas inducidas por IFN pueden llevar a la célula hasta la apoptosis (buen
sistema para evitar la diseminación viral...)
o
También
puede inducir la APOPTOSIS de células vecinas a la infectada.
o
El IFNg
juega un papel importante en la ACTIVACIÓN DEL SISTEMA INMUNE.
o
La producción
de grandes cantidades de IFN tiene importantes efectos fisiológicos en el
organismo: Fiebre, nauseas y malestar generalizado.
o
El estado
antiviral inducido por IFN empieza por la activación de dos proteínas
celulares:
§
Proteín-quinasa
dependiente de dsRNA (Pkr). Es una serin/treonin quinasa, con efecto antiviral y
antiproliferativo. Fosforila la subunidad alfa del factor de la iniciación de
la traducción eIF2, inhibiendo la síntesis de proteínas nuevas.
§
Ribonucleasa
L (RNasa L). Nucleasa capaz de degradar RNA. Esta enzima tiene que ser activada
por otra enzima, la 2’-5’-oligo(A) sintetasa, que produce 2’-5’ poli(A)
que activa la RNasa L y degrada el RNA viral y celular, eliminando a las células
infectadas...
§
IFNg
induce, entre otros muchos genes, la enzima NOS (óxido nítrico sintasa), que
produce NO con un recientemente descubierto efecto antiviral frente algunos
virus...